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Introduction
尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是仅次于鲤鱼的第二大养殖鱼类，占全球水产养殖产量的8%。基因改良的养殖罗非鱼（GIFT）是一种具有改良遗传特性的尼罗罗非鱼品种，它是从尼罗罗非鱼培育出来的。这种物种有更快的生长速度，更高的身体，更厚的背部，以及稳定的遗传特征，并接受补充饲料。由于其丰富的营养、良好的口感和风味，GIFT已成为中国重要的淡水水产养殖品种。
几种饲料添加剂已被用于GIFT养殖。特别是乙氧基喹啉（EQ）是一种广泛使用的常见饲料添加剂，它是一种具有清除脂质过氧化自由基能力的芳香胺。EQ能有效防止饲料中脂肪和蛋白质成分在贮存过程中的氧化。此外，EQ还通过防止过氧化物的形成来保护饲料中的VA和VE。然而，一些研究表明，EQ对动物有有害影响，可能会导致体质量减轻、代谢失衡、免疫紊乱，甚至增加死亡率，而IC50斑马鱼和罗非鱼的EQ范围从10到20 mg/L。由于缺乏对动物、消费者和环境安全性的评估数据，欧盟禁止在饲料中应用EQ（欧盟法规2017/962），但EQ在全球大多数国家仍被广泛使用，其确切危害尚不清楚。除了影响养殖动物外，动物组织中的EQ残留还可能直接影响消费者的健康，受EQ影响的动物可能通过生产不健康的产品间接危害人体。据报道，EQ在水产品和家禽中的残留浓度分别为0.14～24.20 μg/kg和15～238 μg/kg。
据报道，EQ对人类淋巴细胞有毒性作用，并能在人类淋巴细胞中引起DNA损伤。此外，EQ可能会调节养殖动物的肠道微生物群和代谢物，而改变的微生物和代谢物可能会转移到消费者，从而引起二次生物危害。
微生物群包括各种微生物（细菌、真菌、古菌、病毒和原生动物）群落，它们定植在宿主组织中，代表一种重要的酶资源，对食物的消化和吸收有显著的贡献。胃肠道中的高微生物多样性水平对宿主营养、生长和发育至关重要。然而，微生物群中的细菌是鱼类中大多数能够引起人类食源性疾病病原体的代表。
饲料对鱼类的代谢有不同的影响。例如，在欧洲鲈鱼饲料中使用虾粉代替鱼粉，发现前者显著促进鲈鱼的肝脏脂质代谢，另有研究发现鱼饲料中的藻类影响了大西洋鲑鱼幼鱼的脂肪酸代谢。
总之，基于饲料添加剂EQ对罗非鱼微生物群落和代谢以及消费者健康的潜在影响，本工作使用典型的含或不含EQ的低脂和高脂饲料培养了GIFT，然后研究了鱼的生长性能、肠道稳态、微生物群和代谢，并讨论了对消费者潜在的二次生物危害。这项工作为指导EQ在鱼类养殖中的安全应用提供了理论依据和实际数据支持。
Results and Discussion
EQ改变了GIFT的增长表现
为了研究EQ如何影响GIFT的生长，鱼被用包括0.03% EQ的典型低脂和高脂饲料培养。如图所示。图1A和B，在低脂饮食的条件下，添加EQ到饲料中增加了体质量增长，但同时也分别上调了FCR 32.4%和8.6%，这与先前的研究结果一致。作为抗氧化剂，EQ可以防止饲料中的脂质酸败和蛋白质氧化，保持脂溶性维生素的稳定性，并保护饲料中的营养成分和促进生长性能，特别是在脂肪摄入量受限时。然而，在高脂饲料的情况下，在有EQ的情况下，体质量增加和FCR都降低了（分别为16.5%和1.6%）。一些研究表明，高剂量的抗氧化剂补充剂可能是有害的，因为这可能会改变体内保护细胞免受损伤的微妙平衡。此外，在低脂喂养条件下，添加EQ显著降低了存活率，但在高脂喂养的情况下，添加EQ对存活率没有显著影响（图1C）。这些结果表明，EQ的应用对GIFT的生长性能有不同的影响，这取决于饲料的脂肪含量。
图1 不同饲养条件下GIFT的生长表现
EQ导致GIFT肠道组织屏障损伤
为了解释EQ如何改变GIFT的生长性能，建议EQ可能调节肠内稳态，从而影响营养吸收。为了验证这一假设，通过组织学确定了肠屏障的功能。在前面（图2A）和中间（图2B）肠段，当低脂饮食导致肠屏障完好时，添加EQ会导致多绒毛损伤。此外，高脂饮食导致低水平的肠屏障损伤，而添加EQ进一步加剧了损伤。因此，EQ在高脂和低脂饲料中都显著损伤了肠屏障。相反，各组的肠屏蔽在后部（图2C）段完好无损，表明在前一段中，EQ通过消化和吸收而失效。
图2 不同组别GIFT肠段的HE染色
EQ调节GIFT的微生物群
EQ调节肌肉和肠道微生物群的组成
为了评估饮食中的EQ是否调节了鱼类的微生物群，以及改变后的微生物群是否可以被消费者接触，通过16S rDNA测序确定了鱼肉和肠道的微生物群。
先前的研究表明，鱼类肠道微生物群主要由四个门组成，分别是：Proteobacteria、Fusobacteria、Actinobacteria和Firmicutes。同样，本研究还发现这4个科在肠道中占优势。值得注意的是，这四个门也在肉微生物群中占主导地位，这表明肉微生物群的主要来源是肠道。另一方面，在属水平上，GIFT肉和肠中的优势菌包括蜡状芽孢杆菌，莱斯顿菌，根瘤菌，邻单胞菌，肠杆菌和埃希氏-志贺氏菌（图3B）。蜡状芽孢杆菌和棒状杆菌被报道为鱼类肠道中常见的优势菌。当蜡状芽孢杆菌也在肉中大量存在时，根瘤菌的比例较低，此外，高丰度的肠杆菌只在肉中观察到，而不是在肠道中。在优势菌属中，邻单胞菌由一种单菌种组成，志贺氏邻单胞菌，一种常见的革兰氏阴性细菌，已知对鱼类具有致病性，与因食用鱼类而引起的胃肠道疾病爆发有关。埃希氏-志贺氏菌也被认为是鱼类的致病菌，并引起人类急性肠道传染病。普氏菌和埃希氏菌-志贺氏菌在喂食EQ的鱼肉中含量较高，表明饲料中的EQ可能会增加鱼感染的风险，并导致潜在的GIFT二次生物危害。
图3 EQ改变了GIFT的微生物群组成
EQ降低了微生物群的多样性
为了评估不同群体的微生物群稳态，α-和β-多样性聚类OTUs进行了测量。稀释曲线（图4A）表示，测序深度足以进行进一步分析。在OTU聚类分析的基础上进行韦恩图分析，结果表明肉和肠的核心菌群分别由146个和180个OTU组成（图4B）。此外，α-多样性由Chao1和Shannon多样性指数（图4C和D）。虽然Chao1指数在组间差异有限，但香农指数的差异显著。具体来说，在肉样本中，低脂和高脂饲料在没有EQ的情况下没有显著差异，但应用EQ显著降低了低脂和高质量饲料的GIFT中的香农指数。另一方面，在肠道样本中，高脂饲料和EQ均降低了香农指数，但在HFHE组中效果没有叠加。由于Chao1反映了物种丰富度，而Shannon反映了物种多样性，这一结果表明，EQ通过减少肉和肠中的物种多样性而不是物种丰富度来损害α-多样性。
图4 EQ降低了α-多样性GIFT微生物群
同时，β-多样性通过PCA（图5A）和NMDS（图5B）以评估组间微生物群落相似性。PCA显示，EQ显著改变了高脂饲养鱼肉和低脂饲养的鱼肠中的微生物群组组成，而NMDS显示，EQ仅在高脂饲喂鱼肉中调节微生物群。考虑到NMDS包含一种排序方法，以克服线性模型（包括PCA）的缺点，并能更好地反映非线性结构，结果表明，EQ可以改变高脂饲料中鱼肉的微生物群，这可能导致不确定的生物危害风险。
图5 EQ降低了β-多样性GIFT微生物群
EQ改变微生物群的功能
为了进一步研究EQ如何调节GIFT的微生物群，分析了不同细菌的功能。COG通路的聚类分析显示，添加和不添加EQ的GIFT在信息存储和处理、细胞过程和信号传导以及代谢方面存在显著差异（图6A）。有趣的是，在肉类微生物群中，高脂饲养组和低脂饲养对EQ的影响不同。在高脂饲喂组中，EQ上调了涉及细胞过程和信号传导的细菌，但下调了具有代谢功能的细菌；而在低脂饲喂群中，EQ的效果则相反。KEGG通路簇分析显示，在群体感应通道（K02032、K02035、K02034）和次级代谢产物的生物合成通道（K02495）中，EQ和非EQ组之间存在显著差异（图6B）。这些结果表明，EQ调节了GIFT在肉和肠道中的微生物群功能，其具体影响在很大程度上取决于喂养条件。另一方面，肉微生物群代谢的变化可能潜在地影响消费者的健康，需要进一步研究。
图6 EQ改变了微生物群的功能
EQ负面调节GIFT肉中的有益代谢产物
EQ显著改变了肉类代谢组
基于微生物群数据，建议EQ喂养会改变鱼肉微生物群的代谢，此外，在饲料中添加EQ也可能改变鱼的肌肉代谢。为了了解EQ对GIFT鱼肉代谢的全面影响，每个组的代谢物通过基于LC-MS/MS的非靶向代谢组进行评估。PCA显示，在低脂和高脂组中，添加和不添加EQ的饲料形成了两个不同的团簇（图7）。同样，正交部分最小二乘歧视分析（OPLS-DA）表明，在喂养和不喂养EQ的GIFT的肉中，代谢物发生了显著变化（图8A）。排列测试结果表明，原始模型具有良好的鲁棒性，不存在过拟合现象（图8B）。这些结果表明，EQ显著改变了GIFT的肉类代谢组。
图7 通过主成分分析（PCA）对GIFT肉进行代谢组学分析
图8 通过正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）对GIFT肉进行代谢物分析
EQ降低了肉中有益的代谢产物
为了进一步了解EQ如何改变鱼肉的代谢，通过火山图可视化了每组变化的代谢产物（图9A）。在低脂和高脂饲养组中，添加EQ显著改变了肉类代谢物的类型。此外，对代谢组进行了层次聚类分析，详细分析了各组之间的差异代谢物。计算了差异代谢物质定量值的欧几里得距离矩阵，并采用完全连锁方法对差异代谢产物进行聚类。在低脂饲养（图9B），γ-氨基丁酸（GABA）和琥珀酸酐在添加EQ后显著上调。GABA是去甲肾上腺素的代谢产物和一种神经递质，具有显著的有益作用，但也可能引起一些症状，如服用GABA后不久，一些人可能会出现轻微的皮肤刺痛和/或轻微的呼吸短促。另一方面，EQ的应用下调了8种代谢物，如唾液半乳糖、半胱氨酸、核糖、异鼠李素和N-乙酰氨基丁酸，这些代谢物对于人体来说是必需的或有益的。如图9C所示，在高脂喂养组中，添加EQ显著上调了肌苷、癸酸和甲基琥珀酸的浓度。值得注意的是，甲基丁二酸是一系列异常和潜在有害的，因此从肉中摄入甲基丁二酸可能会对健康造成潜在危害。此外，在EQ处理后，对身体有益的氨基酸和维生素，如色氨酸和泛酸，被下调，这表明EQ可能对GIFT肉的营养价值产生负面影响。
值得注意的是，在低脂饲料组和高脂饲料中，应用EQ显著下调了微生物糖的含量。但对微生物糖对人体生理作用的了解有限，EQ诱导的变异是否会影响消费者的健康是一个有趣的问题，需要进一步研究。
图9 EQ减少了肉中的有益代谢物
Conclusion
EQ是一种广泛使用的鱼饲料添加剂，但对其对鱼类和消费者的潜在有害影响尚未完全了解。在这项工作中，评估了EQ对高脂和低脂饲料中GIFT生长和健康的影响，并调查了对消费者潜在的二次生物危害。在低脂饲料条件下，EQ不仅上调了体质量增加，还上调了FCR，并降低了存活率。相反，在高脂饲料条件下，情报下调了体质量增加，并没有在很大程度上改变FCR和GIFT的存活率。此外，在两种喂养条件下肠绒毛都受损。给予EQ导致了肉类微生物群的不同组成和较低的多样性，特别是在低脂喂养组。具体来说，EQ上调了邻单胞菌和大肠杆菌-志贺菌的比例在GIFT的体内微生物群中，这些是潜在的病原体。此外，EQ还改变了肉类代谢组，减少了有益的代谢产物，增加了潜在的有害成分。综上所述，本文阐明了EQ对GIFT生长性能的影响，并暗示了对消费者潜在的二次生物危害。这些发现为指导EQ在饲料中的应用提供了科学依据，并促进了水产养殖技术和管理的改进。
The effect of feed additive ethoxyquin on tilapia growth performance and potential secondary hazard to consumers
Shanjun Chena, Chong Wanga, Yanan Liua, Zhigang Zhoub, Linglin Fua, Yanbo Wanga,c,*
a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China
b Sino-Norway Joint Lab on Fish Gut Microbiota, Institute of Feed Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
c School of Food and Health, Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048, China
*Corresponding author.
Abstract
Ethoxyquin (EQ) is a widely used feed additives for aquaculture, but the potential hazard to fish and consumers are not fully understood. In this work, EQ was applied to tilapia fed with either high-fat or low-fat feed, and the changes in growth performance and intestinal barrier integrality of genetically improved farmed tilapia was observed. Additionally, the microbiota in the intestinal content and flesh was analyzed by 16S rDNA sequencing, and the flesh metabolites was measured by LC-MS/MS untargeted metabolomics. In the low-fat group, EQ increased weight gain and feed conversion rate, but reduced survival rate. In the high-fat group, only weight gain decreased, and there was no significant effect on feed conversion rate and survival rate. Additionally, the intestinal villi and microbiota diversity was impaired in both feeding conditions. Microbiota analysis revealed that EQ resulted in different composition and lower diversity of the flesh microbiota and upregulated the proportion of potential pathogens. EQ also changed the flesh metabolome, decreasing beneficial metabolites and increasing potential harmful components. This work elucidated the effect of EQ on growth performance of tilapia and implied that it has adverse effects on tilapia and may be passed on to consumers.
Reference:
CHEN S J, WANG C, LIU Y N, et al. The effect of feed additive ethoxyquin on tilapia growth performance and potential secondary hazard to consumers[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3236-3244. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250010.
翻译：田雨欣（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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